Structure et fonction des acides nucléiques pour un TPE

Les acides nucléiques sont de grandes molécules présentes dans toutes les cellules et tous les virus. Ces molécules sont constituées de nucléotides, eux‑mêmes composés d’un groupe phosphate, d’un sucre et d’une base azotée.

Les briques élémentaires : les nucléotides

Les « briques élémentaires » des acides nucléiques sont les nucléotides. Les nucléotides sont constitués d'une base azotée, d'un sucre (ribose pour l'ARN ou désoxyribose pour l'ADN) et de phosphate. On peut représenter schématiquement un nucléotide par la figure 1.

Sur la figure 2, on peut voir la différence de formule chimique entre le ribose et le désoxyribose, au niveau du carbone 2'. Figure 2 : Structure des sucres en C5 (5 atomes de carbone) rencontrés respectivement dans l'ARN ou l'ADN. Par convention, les atomes de carbone ne sont pas notés sur le cycle et occupent les sommets des pentagones à l'exception de celui occupé par un atome d'oxygène.

Organisation en chaîne et différences ADN / ARN

Les nucléotides sont reliés entre eux pour former une chaîne continue composée de sucres et de groupes phosphate. Les acides nucléiques sont des biomolécules complexes de grande taille présentes dans les cellules. Ils représentent le matériel génétique des organismes vivants et contiennent les instructions pour la formation et le fonctionnement de tous les êtres vivants.

Parmi les acides nucléiques, on distingue l'ADN (Acide DésoxyriboNucléique) et l'ARN (Acide RiboNucléique). L'ADN et l'ARN sont composés de nucléotides, dont chacun est constitué d’un sucre à 5 atomes de carbone, d’une base azotée et d’un groupe phosphate.

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Dans l’ADN, la molécule est constituée de deux chaînes qui s’enroulent l’une autour de l’autre pour former une double hélice. Cette organisation place les bases azotées à l’intérieur de la structure, où elles s’associent de manière spécifique: l’adénine avec la thymine et la guanine avec la cytosine. À l’inverse, l’ARN est généralement constitué d’une seule chaîne. Dans l'ADN, les nucléotides sont l’adénine, la cytosine, la guanine et la thymine, tandis que l’ARN contient de l’uracile à la place de la thymine.

Polarité et lecture de la séquence

La séquence d'un acide nucléique est représentée d'une façon linéaire; se lit de gauche à droite depuis le 5' phosphate au 3' OH.

Localisation cellulaire et formes biologiques

Chez l’être humain, les acides nucléiques se trouvent à l’intérieur des cellules, principalement dans le noyau et les mitochondries. Il est, chez les Eucaryotes, associé à des protéines (nucléoprotéines). L'ADN est contenu dans le noyau de la cellule. Il y a plusieurs molécules d'ADN par cellule.

Les virus sont des particules formées de l'association d'un seul acide nucléique et des protéines, constituant la nucléocapside. Certains virus ont en plus une enveloppe lipidique. Ils possèdent les acides nucléiques les plus courts... Le virus a dans son ADN les gènes codant pour ses protéines de capside ou d'enveloppe, ainsi que pour des enzymes particuliers.

Structure des génomes : circulaire, linéaire, plasmides

On considère 2 molécules d'ADN bicaténaire circulaire ayant exactement la même séquence de bases. Les notions qui vont suivre ne s'appliquent théoriquement qu'aux ADN circulaires, c'est‑à‑dire qui n'ont pas d'extrémité libre. Du fait que l'ADN est circulaire et double brin, la forme en hélice cause une torsion et des contraintes physiques importantes. L'ADN réalise des boucles tournant en sens inverse par rapport à l'hélice, appelées "supertours" ou "superenroulements".

- Forme I: molécule superenroulée. - Forme III: forme linéaire. Obtenue par digestion de l'ADN par les DNases ou les endonucléases de restriction.

Les plasmides sont des petites unités se répliquant indépendamment du chromosome. Ils sont souvent transmissibles entre bactéries (--> l'apparition de souches résistantes aux antibiotiques dans les hôpitaux).

Propriétés physiques et topologie de l'ADN

Etat relâché: la contrainte (ou la tension) est minimale. Celle qui est adoptée le plus souvent par l'ADN dans la cellule. Etat surenroulé: l'axe de l'hélice peut s'enrouler sur lui‑même en formant une superhélice. La plupart des molécules d'ADN rencontrées dans la nature forment des superhélices gauches. L'ADN est compact: théoriquement, il migrera plus qu'un ADN sous forme linéaire.

Ce sont des enzymes qui modifient le nombre d'enlacements. Il en existe de 2 types: Les topoisomérases I: elles ne coupent qu'un brin de l'ADN bicaténaire. Elles coupent la liaison phosphodiester, l'extrémité 3'OH reste libre tandis que le phosphate en 5' est estérifié momentanément à une tyrosine de l'enzyme. Ces topoisomérases permettent de relâcher des superhélices sous tension. Elles existent chez les Procaryotes et les Eucaryotes. Les topoisomérases II: Elles coupent les 2 brins de l'ADN bicaténaire. Les inhibiteurs de la gyrase bactérienne sont des antibactériens. Les inhibiteurs des topoisomérases humaines sont des anticancéreux.

ADN : composition et propriétés thermodynamiques

L'ADN a été isolé en 1868 mais son rôle dans le support de l'information génétique n'a été démontré que plus tard. Dans l'ADN, la quantité d'A = la quantité de T; [C] = [G]. Le rapport des [A+T] / [C+G] est caractéristique d'une espèce. Le % en GC est utilisé comme critère de classification des bactéries.

On peut suivre l'absorbance en fonction de la température; on obtient la courbe de dénaturation. Celle-ci a une allure sigmoïde. Le point d'inflexion correspond à la température à laquelle des molécules d'ADN sont dénaturées (Tm). Le Tm dépend du pH et de la force ionique, mais surtout du % en GC. Nous avons vu que la température rompt les liaisons hydrogènes entre chaque brin d'ADN.

Une solution d'ADN dénaturé peut être refroidie. Refroidissement lent (ex: on laisse le tube sur la paillasse). Les 2 brins complémentaires se réassocient et on retrouve l'ADN double brin de départ: l'hybridation. Celle‑ci est possible dès que l'on dispose de 2 simple brins complémentaires (ADN/ADN ou ARN/ADN).

Division fonctionnelle des ARN

Les ARN sont des polymères de ribonucléotides liés par des liaisons phosphodiester 5'-3'. Les bases azotées sont A-U, C-G. L'ARN est une molécule monocaténaire, c'est‑à‑dire simple brin. La classification des ARN est liée à leurs fonctions.

Les ARNr sont localisés au niveau des ribosomes: en effet, ces derniers sont en fait des particules à base de 35% de protéines et 65% d'ARN. Ils sont définis en fonction de leur constante de sédimentation : grandeur en svedberg (S). Les ribosomes ont une constante de sédimentation de 70S. On peut les isoler facilement à partir de broyats cellulaires par ultracentrifugation.

Les ARNm sont monocaténaires et ont une durée de vie très courte. Les ARNt sont synthétisés, à partir de l'ADN, dans le noyau des cellules eucaryotes. En effet, ils apportent les acides aminés aux ribosomes pour construire les protéines. Ils sont qualifiés d'adaptateurs. L'extrémité 3'OH fixe l'acide aminé correspondant au codon de l'ARNm.

Rôle des acides nucléiques : du gène à la protéine

Les séquences de nucléotides d'ADN sont organisées en unités appelées gènes, qui contiennent les informations codant pour différentes protéines. Les ARN permettent l'expression de l'information génétique portée par l'ADN. Les altérations et mutations de l'ADN qui modifient la séquence des gènes peuvent entraîner un dysfonctionnement des protéines perturbant la fonction cellulaire normale. Le cancer constitue un excellent exemple de la façon dont les mutations génétiques peuvent perturber la régulation normale du comportement cellulaire, entraînant une croissance cellulaire incontrôlable.

Traduction : du langage nucléotidique au langage protéique

Le mot « traduction » est à prendre au sens littéral : on transforme un langage en un autre langage. Concrètement, on passe d’un message en nucléotides (la séquence de l'ARNm) à un message en acides aminés (la séquence de la protéine).

Il faut pouvoir coder les 20 acides aminés différents, donc il faut une combinaison de nucléotides qui permet d’obtenir au moins 20 solutions. Si on considère un nucléotide, on ne peut coder que 4 solutions. Si on considère 2 nucléotides, on ne peut coder que 4^2 solutions, soit 16 acides aminés. Si on prend 3 nucléotides (triplet), on peut coder 4^3, soit 64 solutions, ce qui est supérieur au nombre d’acides aminés. Chaque triplet est appelé codon.

La Nature ayant horreur du vide, et pour éviter les ambiguïtés, les acides aminés sont codés par plusieurs triplets différents. Aucun triplet n’a pas de code associé. Les ARN de transfert (ARNt) sont les molécules qui font le lien entre les deux langages (nucléotides et acides aminés). Lors de la lecture de la séquence en nucléotides de l'ARNm, la machinerie cellulaire (ribosome) fait correspondre le codon lu et l’anticodon porté par l’ARNt.

Mécanisme de la traduction : initiation, élongation, terminaison

Initiation : reconnaissance par la petite sous-unité du ribosome (30 S) d’une séquence signal située en amont du codon initiateur = séquence Shine‑Dalgarno. Le codon initiateur est toujours le codon AUG, il correspond à la méthionine : une méthionine modifiée (formyl‑méthionine) se fixe en acide aminé 1 (AA1).

Il n’existe pas de séquence Shine‑Dalgarno chez les Eucaryotes.

Élongation : fixation de l’acide aminé (ou peptide en formation) de l’ARNt du site P sur l’acide aminé de l’ARNt du site A. Cette réaction est catalysée par la peptidyl‑transférase, située dans 50 S (on déplace bien un peptide !). Translocation du ribosome de 3 nucléotides vers 3’ (= 1 codon), avec éjection de l’ARNt du site P, remplacé par l’ARNt du site A. Le site A se retrouve vide.

Le ribosome possède deux chambres : site A et site P. Le site A est le site qui accueille le nouvel ARNt associé à son acide aminé. Le site P contient le dernier ARNt dont l’acide aminé a été fixé au peptide en production.

Terminaison : lorsque le site A se trouve en face du codon « STOP », aucun ARNt ne peut se fixer dans le site A.

Élongation (dans certains cas) : elle se déroule soit dans le cytoplasme, soit dans le réticulum endoplasmique (RE). Dans ce cas (RE), la séquence de la protéine présente, dès le début de sa formation, une succession d’acides aminés reconnus par la PRS (particule de reconnaissance du signal). PRS se fixe sur la séquence, et « force » le ribosome à se rapprocher du RE, en se fixant sur un récepteur à PRS (RPRS). À ce moment‑là, le peptide produit est libéré, au fur et à mesure de sa formation, dans la lumière du RE, grâce à un pore.

Enzymologie et manipulation des acides nucléiques

La réplication nécessite des nucléotides désoxyribonucléotides triphosphates (dNTP). Il s'agit d'endonucléases, de nucléases et d'autres enzymes spécifiques qui coupent ou modifient les acides nucléiques. Les endonucléases de restriction coupent l'ADN au sein de séquences spécifiques. Les premières DNAses connues étaient moins spécifiques que les RNAses.

Il existe des enzymes qui détachent les groupements phosphates situés aux extrémités d'un polynucléotide. Certaines endonucléases ont des spécificités particulières: une endonucléase coupe lorsqu'il y a du côté 3' une guanosine (ou une inosine). D'autres ont une spécificité plus large: A ou G côté 3'. Leur utilisation en combinaison est fréquente pour analyser des ARN.

L'hydrolyse alcaline de l'ARN se fait selon un mécanisme impliquant un composé intermédiaire cyclique 2'-3' ; en rompant les liaisons phosphodiester, on obtient un mélange de nucléosides 2' et 3' monophosphates et l'hydrolyse des ARN est ainsi totale.

Techniques analytiques et applications

Nécessité technique: la solution d'ADN doit être pure. Avant d’être utilisés dans des applications en aval, les acides nucléiques sont détectés et quantifiés par UV ou spectrophotométrie de fluorescence. On peut suivre l'absorbance en fonction de la température pour obtenir la courbe de dénaturation.

Actuellement, on sépare des fragments allant de 1 à 300 nucléotides (gels de 40 cm de long). La séparation des fragments et leur séquençage permettent d'identifier la composition en bases. La révélation se fait par autoradiographie. On utilise aussi l'hybridation pour détecter la présence de séquences complémentaires.

L'acide nucléique est souvent purifié à partir de cellules dans le cadre d'une gamme grandissante de méthodes de biologie moléculaire, notamment le séquençage et l'édition génomique. Molecular Devices offre une solution de flux de travail complète pour la détection, la quantification et l’analyse des acides nucléiques.

Méthodes d'étude et manipulations courantes

La purification des acides nucléiques utilise souvent des mélanges phénol‑chloroforme car ils sont efficaces. En concentration saline plus importante, l'ADN précipite (phénomène de « relarguage »). Après hydrolyse chimique ou enzymatique, on sépare les fragments par chromatographie ou électrophorèse.

Pour le séquençage, on peut utiliser des didéoxynucléotides : lorsqu'un tel nucléotide est incorporé, il y a arrêt de la synthèse. On obtient ainsi une série de fragments d'ADN ne différant que d'un seul nucléotide et se terminant par un didéoxynucléotide. Historiquement, la détection se faisait par autoradiographie.

La manipulation des acides nucléiques est à la base de nombreuses applications : séquençage, PCR, clonage, édition génomique. Ces techniques requièrent une attention particulière à la pureté et à l'intégrité des molécules étudiées.

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