Valorisation des métabolites : procédés et applications

Dans l'agronomie, le nombre croissant de rapports dans le domaine des interactions plantes-bactéries-champignons fournit de plus en plus de connaissances sur la nature et la fonction des communautés microbiennes de la rhizosphère. Ces interactions plantes-microorganismes peuvent être, en grande partie, liées à des métabolites secondaires microbiens sécrétés par ces microorganismes, mais de nombreux autres ne sont pas encore caractérisés.

Pourquoi se concentrer sur les métabolites secondaires bactériens ?

Ce sont les métabolites secondaires libérés par des bactéries particulières qui feront l'objet de notre attention. Les raisons suivantes ont guidé ce choix:

(i) Un besoin environnemental et sociétal nous oblige à produire des aliments sans pesticides.
(ii) Les bactéries sélectionnées dans cette étude ont montré un effet agronomique efficace pour stimuler les plantes et n'ont pas été étudiées pour les applications envisagées dans ce projet.
(iii) Remplacer les formulations agronomiques existantes par des produits basés sur les métabolites secondaires ayant une efficacité améliorée tout en respectant l'environnement.
(iv) La variété chimique des métabolites secondaires produits par ces bactéries nous invite à les évaluer pour des activités pharmaceutiques (exemple cas de résistance).

Objectifs et motivation des projets de valorisation

L'objectif de VAMAGPHAR est d'identifier et de développer des métabolites bactériens secondaires qui peuvent être utilisés dans l'agriculture comme biostimulants et/ou un traitement pharmaceutique comme nouvelle source de molécules actives, pour répondre à des questions de santé publique indirectement (agriculture) en substituant l'apport chimique en engrais et pesticides ou directement (pharmaceutique).

La production de métabolites secondaires à partir de bactéries (Agronutrition) et d'extraction, de fractionnement et d'identification de molécules (LGC-pharma) a déjà été réalisée sur deux modèles de bactéries (Burkholderia sp. et Bacillus megaterium) dans le cadre d'une thèse collaborative (Belkacem, 2016). Une centaine de molécules ont été identifiées et une vingtaine d'entre elles ont été citées dans la littérature pour la première fois. Ces premiers résultats originaux nous ont encouragés à élargir le travail avec d'autres partenaires, objectifs et microorganismes. Les activités pharmaceutiques (antioxydantes, antimicrobiennes et cytotoxiques) ont été choisies suite à des activités intéressantes obtenues lors du travail de thèse de M Belkacem.

Procédés de production et d'extraction

Des plantes aux plateformes de production. Une nouvelle démarche s’appuyant sur des cultures de végétaux hors-sol (hydroponie, aéroponie) est venue compléter les cultures cellulaires, assurant la collecte répétée de métabolites exsudés par les racines, ou récoltés à partir des parties aériennes, sans destruction de la plante. Plus récemment, des avancées en ingénierie métabolique ont été rendues possibles par la compréhension fine des voies spécialisées permettant ainsi de reprogrammer et d’optimiser leur fonctionnement dans des organismes microbiens.

L’isolement par chromatographie des molécules recherchées est réalisé conjointement par les partenaires français et allemand. La caractérisation structurale des métabolites secondaires est réalisés par le partenaire allemand grâce à la mise en œuvre de diverses techniques de spectrométrie de masse et de résonance magnétique nucléaire. Par la suite, les voies de biosynthèse respectives de ces métabolites secondaires sont affinées au regard de la structures des molécules.

L’extraction des métabolites est une étape cruciale du profilage métabolique. La métabolomique à haut débit permet de quantifier un large éventail de métabolites au moyen de techniques telles que la chromatographie couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS, GC-MS). La plupart des processus de spectrométrie de masse commencent par une étape d’extraction de métabolites. L’optimisation des protocoles de préparation d’échantillons peut considérablement améliorer la récupération des métabolites extraits. Le protocole de préparation d’échantillons applicable à l’extraction des métabolites a donc un impact majeur sur les résultats des études métabolomiques.

Bertin Technologies a mis au point Precellys, une gamme d’homogénéisateurs à haut débit. Ils constituent une solution éprouvée pour homogénéiser les échantillons destinés aux études métabolomiques.

Caractérisation structurale et biosynthèse : cas d'études bacteriennes

Au sein de l'équipe BRIO de l'institut de santé des plantes de Montpellier (Cirad, UMR PHIM), nous étudions les interactions entre des micro-organismes phytopathogènes et leurs plantes cibles. Nous sommes spécialisés dans la (sur)production, l'isolement et la caractérisation de la structure et de la voie de biosynthèse de métabolites secondaires d'intérêt, en collaboration avec l'équipe du Prof.

Les objectifs de ce projet sont doubles: le premier objectif est de déterminer la structure de deux nouveaux métabolites secondaires contenant un acide aminé ß. Les activités biologiques de ces métabolites secondaires (une molécule impliquée dans le quorum sensing et une molécule antifongique, respectivement) en font des molécules d'intérêt pour, respectivement, perturber la virulence d'une bactérie pathogène (quorum quenching), et développer des méthodes de biocontrôle.

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Le second objectif est de rechercher, par genome mining, la présence d'autres groupements de gènes similaires codant l'incorporation d'acides aminés ß parmi l'ensemble des génomes bactériens disponibles dans les banques de données, dans le but d'identifier de nouveaux loci prometteurs pour la découverte de métabolites secondaires présentant potentiellement de nouvelles activités biologiques.

Le premier métabolite secondaire bactérien est un lipopeptide produit par un complexe d'espèces bactériennes phytopathogènes et pathogènes opportunistes d'animaux et de l'Homme. Ce lipopeptide a été montré comme impliqué dans la virulence de la bactérie chez des patients souffrant de mucoviscidose mais également comme ayant des propriétés antifongiques contre des champignons phytopathogènes. Si un protocole d'isolement était connu pour ce lipopeptide au début de ce projet, les différents partenaires du projet en ont élucidé la structure, confirmant au passage l'hypothèse principale du projet de la présence de beta-acides aminés dans les structures des métabolites étudiés, mais également sa voie de biosynthèse impliquant des enzymes de la voie de biosynthèse peptidique non ribosomique.

Le second métabolite secondaire bactérien étudié dans ce projet est la molécule signal d'un système de quorum sensing original impliqué dans la virulence de souches appartenant aux différentes espèces d'un genre bactérien phytopathogène. L'isolement de cette molécule signal a été rendu difficile par les très faibles concentrations produites naturellement ainsi que par une forte instabilité de la molécule. De nombreuses analyses des génomes disponibles de ce genre bactérien, et plus particulièrement des gènes impliqués dans la biosynthèse de cette molécule signal, ont permis de mettre en évidence l'existence de plusieurs groupes de spécificité au sein du genre bactérien étudié.

Ces groupes de spécificité mettent ainsi en œuvre des analogues structuraux de la molécule signal de quorum sensing. Ainsi, si le quorum sensing est considéré comme un langage spécifique au sein de certaines espèces bactériennes, les groupes de spécificité mis en évidence dans ce projet correspondent ainsi à des dialectes compris par certaines souches seulement au sein du genre bactérien.

Découverte guidée par le génome et nouvelles familles enzymatiques

Au cours des dernières années, un nombre considérable de métabolites secondaires contenant des acides aminés non protéinogènes a été décrit chez les bactéries. Les études portant sur leurs clusters de gènes de biosynthèse sont également nombreuses. Une nouvelle famille de domaines d'adénylation (A) autonomes impliqués dans l'incorporation d'acides aminés ß a ainsi été décrite. Sur la base des analyses structurales protéiques de trois membres de cette nouvelle famille, de nouveaux codes conférant une spécificité pour des acides aminés ß ont été proposés.

Sur la base de ces caractéristiques spécifiques, le partenaire français (BGPI) a identifié deux nouveaux domaines A autonomes dont on pense qu’ils sont impliqués dans l'incorporation d'un acide aminé ß. Ces domaines A autonomes sont présents dans deux loci appartenant à des bactéries pathogènes importantes. Selon leur annotation, ces loci codent respectivement deux nouvelles molécules inconnues. Il est intéressant de noter que, par une approche génétique, il a été démontré que ces deux loci sont nécessaires à la virulence bactérienne. Cependant, la structure chimique des métabolites secondaires synthétisés par ces loci reste inconnue et la présence d'un acide aminé ß n'a jamais été suspectée ni explorée.

Puisque l'exploration du génome est une approche importante pour découvrir de nouveaux loci codant pour de nouveaux produits naturels ayant des activités biologiques potentiellement nouvelles, ce projet propose d'explorer les séquences génomiques bactériennes disponibles dans Genbank pour la présence de nouveaux loci codant un domaine A autonome spécifique d'un acide aminé ß. En fonction de l'activité biologique des métabolites secondaires caractérisés contenant un acide aminé ß, ce projet pourrait potentiellement mener à des applications industrielles comme antibiotiques ou agents phytosanitaires. Les brevets obtenus pourraient également contribuer à la visibilité du projet.

Applications agronomiques : biostimulants et biocontrôle

Les activités biologiques observées, notamment des molécules antifongiques et des molécules perturbant le quorum sensing, en font des molécules d'intérêt pour développer des méthodes de biocontrôle ou perturber la virulence d'une bactérie pathogène (quorum quenching). Ces approches ouvrent la voie à remplacer des apports chimiques en engrais et pesticides par des produits basés sur des métabolites secondaires ayant une efficacité améliorée tout en respectant l'environnement.

Dans le cadre de la transition agro-écologique, la politique agricole vise une augmentation conséquente des cultures de diversification. Pour l’accélérer, une des pistes serait d’améliorer la valorisation des produits et coproduits qui en sont issus. Afin d'identifier les tendances en la matière, des études ont estimé les valorisations économiques actuelles et futures pour diverses cultures de diversification, montrant qu'une valorisation plus complète des produits et coproduits végétaux sera nécessaire pour renforcer leur compétitivité.

Valorisation des coproduits et synergies avec métabolites

Au-delà de la meilleure utilisation des produits, il sera de plus en plus nécessaire de valoriser les coproduits : ils représentent 40 % des volumes récoltés et seulement 26 % des chiffres d’affaires générés. Pour les prochaines années, cinq défis plus précis ont été mis en lumière par l’étude.

Pour chacune des cultures étudiées, il serait utile d'identifier les procédés par lesquels des molécules d'intérêt pourraient être concentrées, afin de mieux valoriser les coproduits. La synthèse végétale de métabolites secondaires (phytométabolites) - composés phénoliques, terpènes, alcaloïdes - constitue des molécules bioactives intéressantes pour une valorisation industrielle. Toutefois, des freins existent : faible concentration induisant des coûts d'extraction élevés, complexité des procédures d’autorisation de mise en marché, volumes minimums nécessaires, concurrence des mêmes molécules obtenues par voie biotechnologique.

Applications pharmaceutiques et biotechnologie

Les activités pharmaceutiques (antioxydantes, antimicrobiennes et cytotoxiques) ont été choisies suite à des activités intéressantes obtenues lors du travail de thèse de M Belkacem. Dans la métabolomique, la mise en évidence de biomarqueurs sensibles et l'identification de métabolites d'intérêt facilitent le développement de médicaments et la détection précoce de toxicités.

Un exemple illustre le rôle de la métabolomique : dans une étude sur un agoniste des récepteurs de l'acide nicotinique (SCH 900424), le sulfate de 3-indoxyle (3IS) s'est révélé être l'un des principaux biomarqueurs de l'insuffisance rénale aiguë induite, plus sensible que la créatinine ou l'urée. Ces résultats montrent comment la métabolomique peut transformer une observation phénotypique non caractérisée en un profil de biomarqueurs fondé sur les mécanismes sous-jacents.

Autre illustration : l'utilisation d'un produit biothérapeutique vivant (VOS/SER-109) pour prévenir les infections récurrentes à Clostridioides difficile. Des analyses métabolomiques ont montré une corrélation entre la colonisation par les espèces de VOS et l'augmentation des acides biliaires secondaires (LCA, DCA), ce qui a permis d'expliquer l'échec d'un essai de phase 2 par un dosage sous-optimal et de repenser le dosage pour le succès en phase 3.

Sources non bactériennes : microalgues et végétaux comme réservoirs de métabolites

Les microalgues présentes à la fois dans les eaux douces et salées compteraient plus de 200 000 espèces. Cette diversité en fait une source potentielle de métabolites spécialisés originaux. Parmi les principales familles de substances naturelles valorisées actuellement, on peut citer les pigments, lipides, protéines, polysaccharides, caroténoïdes.

Une vision plus globale du métabolome de chacune des espèces apparaît aujourd’hui nécessaire pour mieux mettre en valeur le potentiel commercial que représente cette « microbiodiversité ». Pour cela, une approche combinant HPTLC, RMN et UHPLC-QTOF permet une visualisation large. Cette méthodologie a conduit à l'isolement et la caractérisation de molécules originales, par exemple le cumbriamide, un peptide portant un motif isoprényl caractérisé au sein de Lyngbya sp.

Mise en perspective : opportunités et verrous

Les opportunités sont nombreuses : substitution des pesticides chimiques par des métabolites microbiaux, nouvelles molécules pharmaceutiques, valorisation des coproduits agricoles, développement de filières locales à haute valeur ajoutée. Cependant, des verrous technologiques, économiques et réglementaires demeurent :

faible concentration des molécules dans les matrices naturelles, induisant des coûts d'extraction élevés ;
complexité des procédures d'autorisation de mise en marché ;
besoin de volumes minimums pour rentabiliser les procédés ;
concurrence des voies biotechnologiques permettant de produire identiquement certaines molécules.

Pour répondre à ces défis, il est nécessaire d'investir dans des outils de transformation, d'améliorer les procédés de fractionnement et d'extraction, et d'utiliser la métabolomique et le genome mining pour prioriser les loci biosynthétiques prometteurs. Des innovations de rupture sur les procédés de transformation et la logistique seront nécessaires, compte tenu des tailles critiques des outils et des hauts niveaux d’investissements à rentabiliser.

Tableau récapitulatif : étapes clefs du parcours de valorisation

Étape	Description
Collecte et culture	Isolement de souches microbiennes / cultures hors-sol (hydroponie, aéroponie)
Surproduction	Surexpression génétique des loci biosynthétiques pour augmenter les rendements
Extraction & fractionnement	Procédés chromatographiques, homogénéisation haute cadence, optimisation des solvants
Caractérisation	LC-MS, RMN, UHPLC-QTOF, spectrométrie de masse pour déterminer la structure
Évaluation biologique	Tests antioxydants, antimicrobiens, cytotoxiques, quorum quenching, biocontrôle
Développement industriel	Optimisation des procédés, production à l’échelle, dossier réglementaire, valorisation des coproduits

Perspectives

La combinaison d'approches - métabolomique, genome mining, ingénierie métabolique, procédés d'extraction optimisés et valorisation des coproduits - ouvre des perspectives réelles pour développer des solutions agricoles et pharmaceutiques innovantes. Les travaux menés sur des bactéries modèles et des loci codant des domaines A autonomes illustrent la puissance de la découverte guidée par le génome pour identifier des métabolites originaux contenant des acides aminés ß, aux applications potentielles multiples.

Enfin, la valorisation complète des produits et coproduits végétaux issus de cultures de diversification, couplée à la découverte et au développement de métabolites secondaires microbiaux, contribuera à la compétitivité des filières, à la substitution d'intrants chimiques et à l'émergence de nouvelles chaînes de valeur en agriculture et en pharmacie.

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